1发酵在毒性动物类中药中的应用
事实上，与植物类中药相比，发酵应用于毒性动物类中药的研究报道很少。斑蝥主要含斑蝥素、脂肪等成分，临床用于破血消癓，功毒蚀疮，引赤发泡。斑蝥素对多种实验动物肿瘤有一定抑制作用，尤其当腹水型肿瘤接种的瘤细胞数较少时，可见小鼠生存期延长。其作用机制可能是抑制蛋白质与核酸的合成。临床上对皮肤、粘膜有强烈的刺激性，能引起充血，起泡，口服毒性很大，米炒能降低其毒性及矫正其气味。李晓飞等[29]从锯角豆芫菁EpicautagorhamiMarseul幼虫虫体身上分离得到的白色真菌，经鉴定为球孢白僵菌Beauveriabassian，球孢白僵菌可以有效地降解斑蝥素，降解率达90.45%，可以利用这一研究来安全合理地应用斑蝥素，并可以深入研究斑蝥素的生物降解产物的药物活性。叶敏等[30]往桔梗悬浮培养体系中加入斑蝥素培养6d，培养液分离纯化得到混合存在的两个转化产物，鉴定为一对差向异构体1β-羟基斑蝥素和1α-羟基斑蝥素，且均为未见报道的新化合物。水蛭素（hirudin）因最早从水蛭中分离得到而得名。天然水蛭素由65个氨基酸残基组成，相对分子质量7000。水蛭素能同凝血酶的催化中心及纤维蛋白原结合中心发生不可逆的结合，使凝血酶失活，为目前发现的最强有力的凝血酶抑制剂。研究表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用，它能防止肿瘤细胞的转移，已证明有效的肿瘤有纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病细胞等。水蛭素配合化学治疗和放射治疗，可促进肿瘤中的血流从而增强疗效。然而，水蛭素能阻止凝血酶的作用，引起内脏广泛出血。有肾毒性，可导致肾脏损害。莫炜等[31]构建了重组双功能水蛭素（r-RGD-Hirudin）cDNA的表达质粒RGD-Hirudin.pPIC9K，转化入毕赤酵母中，经筛选得到高表达的阳性克隆。种子菌经过3d发酵培养，其培养液上清液经超滤浓缩、凝胶过滤层析和离子交换层析后，得到纯度大于97%、比活性为12000ATU/mg的r-RGD-Hirudin，回收率大于60%，发酵产率为1g/L。纯化后r-RGD-Hirudin经过SDS-PAGE，抗凝血酶活力分析、抗血小板聚集分析、质谱分析及等电聚焦分析等方法鉴定，证明该表达产物为水蛭素的衍生物，具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重功能。周祥山等[32]研究重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产生了4种具有较高比活的水蛭素异构体，毕赤酵母发酵过程中水蛭素存在降解，Hir65降解产生了Hir62和Hir63。刘高强等[33]研究了几种药用昆虫对灵芝深层培养过程中细胞生长和三萜产物形成的影响。结果表明，蜣螂虫粉的添加，能显著促进灵芝胞外三萜的形成（P<0.01）。刘高强等[34]还研究了几种昆虫的水提物和醇提物对灵芝深层发酵生产菌体和多糖的影响。结果表明，松毛虫水提物能促进灵芝菌体的生长，其中斑蝥提取物对灵芝菌体的生长表现出明显的抑制作用。蜣螂水提物能显著提高灵芝胞内多糖的产量，地鳖虫醇提物以及松毛虫醇提物对胞内多糖的生产也具有促进作用。此外，蜣螂醇提物对胞外多糖的生产具有促进作用。刘高强等[35]采用体外高通量筛选技术检测了补加药用昆虫蜣螂前后灵芝发酵产物的体外抗肿瘤活性。在补加蜣螂发酵后，胞外三萜样品对BEL7402细胞的抑制作用得到了增强，提示lucidoneC可能增强了补加蜣螂后灵芝胞外总三萜对BEL7402细胞的抑制作用。以上都是研究昆虫对灵芝发酵后的影响，中药很多毒类药材都有毒性，如斑蝥、青娘子、红娘子、全蝎和蜈蚣等，这方面的发酵解毒研究值得期待。
2发酵在毒性矿物类中药中的应用
要不是通过商业产品的生物浸出而回收金属的技术，发酵应用于毒性矿物类中药几乎不可能[36]。雄黄是常用的矿物药，雄黄和含雄黄中成药有多种疗效，在中药中具有举足轻重的地位。但是雄黄常以未溶解状态的粗糙矿物原粉入药，造成用量大、毒性严重超标，常有使用雄黄造成不良反应者。因而雄黄和含雄黄中成药在国际市场上受到了限制。杜文静利用分离鉴定的一株高活性的氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans，简称At.f）对矿物药雄黄进行浸出处理，比较普通氧化亚铁硫杆菌和经耐砷驯化后的氧化亚铁硫杆菌对雄黄的浸出效果，测定雄黄微生物浸出液的急性毒性，并初步研究雄黄微生物浸出液的体外、体内抑菌作用。谢亲建研究采用微生物对雄黄进行生物浸出处理以提高其溶解度和生物利用度；以白血病K562和K562ADM细胞为模型，研究了雄黄的浸出液对肿瘤细胞增殖的影响及其诱导细胞凋亡的作用；采用毛细管电泳分析法对雄黄生物浸出液进行分离分析以期确定它的药效成分；对雄黄生物浸出液的急性毒性和药物动力学进行考察。李红玉研究的雄黄微生物浸出液在制备抗肿瘤药物中的应用已经申请专利。朱砂是常用的镇静安神药，在中药中具有举足轻重的地位。但是朱砂常以未溶解状态的粗糙矿物原粉入药，造成用量大、毒性严重超标，常有使用朱砂造成不良反应者。因而朱砂和含朱砂中成药在国际市场上受到了限制。苏丽春[35]利用分离鉴定的一株高活性的At.f对矿物药朱砂进行浸出处理，研究其摇瓶浸出的最佳实验条件，对朱砂浸出液的镇静安神和抗惊厥药效实验进行了初步的探讨，并初步检验了朱砂浸出液的抑菌效果。
3展望
中药经过发酵有很多优点，目前对优良菌种的筛选、优化发酵终点的判断，对已有活性成分和新成分的提取分离等研究较多，而对发酵减毒增效机理研究较少，建立发酵制品推广应用大规模生产的质量标准尚属空白。天然培养基中添加适量中药成分的混合培养基研究有望成为未来的研究热点。我们认为对发酵中药的研究可以从以下几个方面开展工作：1）加强功能性微生物的菌种选育工作；2）毒性中药发酵减毒增效分子机理研究；3）中药发酵技术及设备的研究；4）复合微生物发酵技术的研究；5）研究在发酵中药过程中如何实现中医理论的指导并采纳现代中医药的新技术、新成果。对中药的成分进行生物转化，通过药理筛选模型来确定转化前后药效的变化，需要中药学、微生物学、分析化学、药理学等多学科参与。随着多学科的交叉发展，微生物发酵在有毒中药的研究中必将取得长足的发展，微生物发酵中药也必将表现出强大的生命力。应用现代生物技术大规模提取中药的有效成分、将发酵技术应用于有毒中药的炮制是一项很有前景的课题。同时，利用微生物发酵便于实现产业化和与国际标准接轨，对扩大中药治疗范围、剂型改进、创制新药方面提供新的技术手段，有利于提高我国中药综合利用的现代化水平，给中药研究注入新的内容和活力，为中药走向世界、造福全人类起着进一步的推动作用。
作者：杨光明 涂霞 潘扬 单位：南京中医药大学 南京中医药大学 药用菌与中药生物技术研究所