ＴＧ２和ＭＭＰ－９及Ｖｉｍ－ｅｎｔｉｎ蛋白表达检测转染７２ｈ后，采用蛋白质印迹检测ＴＧ２、ＭＭＰ－９和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白的表达。常规方法提取ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞蛋白样品，行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶配制和电泳，选用ＰＶＤＦ膜转膜，用５０ｇ／Ｌ脱脂奶粉封闭２ｈ后。一抗室温２ｈ，４℃过夜孵育，第２天再室温１ｈ；二抗室温２ｈ孵育。ＥＣＬ化学发光，显影，定影后图像分析仪扫描，ＩｍａｇｅＪ软件分析条带灰度值。
１标本来源
收集２０１２－０５－１０－２０１４－０７－２９广西医科大学第一附属医院（４６例）和江西省肿瘤医院（３５例）手术切除的乳腺浸润性导管癌患者８１例，均经病理确诊。癌旁组织距肿瘤边缘＞２ｃｍ的无癌组织，并经病理检测证实。患者均为女性，年龄３５～６０岁，中位年龄４８岁。原发肿瘤直径１．５ｃｍ～５．０ｃｍ，腋窝淋巴结转移数目≤３枚，无远处转移（患者受检淋巴结数目均＞１０枚）。所有患者术前均未接受过放疗和化疗。经医院伦理委员会批准，对患者癌组织和癌旁组织行免疫组化检测ＴＧ２和ＭＭＰ－９及Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达水平。实验步骤按说明书（ＰＶ二步法免疫组化检测试剂盒）进行，各蛋白所有标本在相同条件下检测，相同病理科医生评分。１．６结果判定标准ＴＧ２、ＭＭＰ－９和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ染色阳性判断标准以肿瘤细胞的胞质内出现棕黄色染色为阳性。在显微镜下随机选择５个高倍（×４００）视野，每个视野计数１００个细胞，结果根据肿瘤细胞着色比例，分为４级：无着色为阴性（－），阳性细胞比例＜２５％为弱阳性（＋），阳性细胞比例２５％～５０％为中度阳性（＋＋），阳性细胞比例＞５０％为强阳性（＋＋＋）。考虑到肿瘤细胞Ｖｉｍｅｎｔｉｎ阳性染色数目相对较少，肿瘤细胞中只要出现阳性染色则判断为阳性［３］。１．７统计学方法采用ＳＰＳＳ１６．０统计细胞实验部分计量资料采用ｘ－±ｓ表示，各组比较用方差分析或非参数检验。临床免疫组化测定资料，两样本率的检验采用χ２检验或Ｆｉｓｈｅｒ精确检验法，采用Ｓｐｅａｒｍａｎ进行相关分析。检验水准α＝０．０５。
２结果
２．１ＴＧＭ２ｍＲＮＡ表达
ＴＧＭ２ｓｈＲＮＡ转染ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞９６ｈ后，ＴＧＭ２ｓｈＲＮＡ表达结果显示，Ｃｏｎ组ＴＧＭ２ｍＲ－ＮＡ表达量为１，ＲＮＡｉ组ＴＧＭ２ｍＲＮＡ表达量为０．２１±０．０３，明显低于Ｃｏｎ组，ｚ＝－２．０８７，Ｐ＝０．０３６９；明显低于ＮＣ组的０．９４±０．０５，ｚ＝－１．９６４，Ｐ＝０．０４９５。表明ＴＧＭ２ｓｈＲＮＡ能有效抑制ＴＧＭ２ｍＲＮＡ的表达。
２．２Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ肿瘤细胞侵袭和迁移实验
侵袭到滤膜下的细胞数ＲＮＡｉ组为４２．３３±４．０４，低于Ｃｏｎ组（９３．５０±７．４２）和ＮＣ组（８７．２５±５．７４），ｚ值均＝－２．１２１，Ｐ值均＝０．０３３９。迁移到滤膜下的细胞数ＲＮＡｉ组为６６．１３±４．５９，低于Ｃｏｎ组（１１６．７５±７．８２）和ＮＣ组（１０９．００±７．７９），ｚ值均＝－２．３０９，Ｐ值均＝０．０２０９。
２．３ＴＧ２和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ及ＭＭＰ－９蛋白的表达
蛋白质印迹检测结果如图１显示，ＲＮＡｉ组、ＮＣ组和Ｃｏｎ组ＴＧ２蛋白相对表达量分别为０．３４±０．０６、０．８７±０．１０和０．９５±０．０３。Ｌｅｖｅｎｅ方差齐性检验，Ｆ＝２．９２，Ｐ＝０．１３；３组均数差异有统计学意义，Ｆ＝６６．５５，Ｐ＜０．００１。ＬＳＤ检验，ＲＮＡｉ组低于Ｃｏｎ组和ＮＣ组，Ｐ值均＜０．００１。ＲＮＡｉ组Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白相对表达量为０．４５±０．０５，低于ＮＣ组的０．８９±０．０７和Ｃｏｎ组的０．９０±０．０３。Ｌｅｖｅｎｅ方差齐性检验，Ｆ＝１．１６，Ｐ＝０．３８；３组均数差异有统计学意义，Ｆ＝８０．５６，Ｐ＜０．００１。ＬＳＤ检验，ＲＮＡｉ组低于Ｃｏｎ组和ＮＣ组，Ｐ值均＜０．００１。ＲＮＡｉ组、ＮＣ组和Ｃｏｎ组ＭＭＰ－９蛋白相对表达量分别为０．０９±０．０２、０．１８±０．０３和０．１９±０．０４。Ｌｅｖｅｎｅ方差齐性检验，Ｆ＝０．３４，Ｐ＝０．７３；３组均数差异有统计学意义，Ｆ＝１２．８９，Ｐ＝０．００７。ＬＳＤ检验，ＲＮＡｉ组低于ＮＣ组（Ｐ＝０．００７）和Ｃｏｎ组（Ｐ＝０．００３）。与非参数法检验结果相同。
２．４ＴＧ２表达水平与乳腺癌淋巴结转移关系
图２所示，ＴＧ２表达主要位于细胞质和胞膜；Ｖｉ－ｍｅｎｔｉｎ表达主要位于间质中，在少数癌细胞也出现表达；ＭＭＰ－９表达主要位于细胞质。表１所示，ＴＧ２的表达水平与年龄、肿瘤分化程度和月经状态无显著相关性，而与淋巴结转移、ＥＲ表达水平和ＴＮＭ分期相关。淋巴结转移组乳腺癌组织中ＴＧ２阳性表达率为７５．０％，而在淋巴结未转移组中ＴＧ２阳性表达率为３２．４％，差异有统计学意义，χ２＝１４．７５，Ｐ＜０．００１。
２．５ＴＧ２与Ｖｉｍｅｎｔｉｎ及ＭＭＰ－９表达相关性
Ｓｐｅａｒｍａｎ相关分析如表２所示，ＴＧ２与Ｖｉｍｅｎ－ｔｉｎ表示水平呈正相关，ｒ＝０．３３７，Ｐ＝０．００２；与ＭＭＰ－９表达水平呈正相关，ｒ＝０．３５８，Ｐ＝０．００１。
３讨论
上皮－间质转化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）和细胞外基质与肿瘤侵袭转移密切相关［４］。本研究推测，ＴＧ２可能与ＥＭＴ和细胞外基质存在内在联系。Ｖｉｍｅｎｔｉｎ是上皮间质转化过程中重要的生物标志［５］。ＭＭＰ－９是蛋白水解酶重要成员，能降解细胞外基质，增加细胞的运动能力，与肿瘤侵袭和转移密切相关［６］。因此本研究通过检测Ｖｉｍｅｎｔｉｎ和ＭＭＰ－９表达水平，探讨ＴＧ２表达水平与侵袭转移的关系。
作者：贺文兴 黄传生 全军利 吴斯明 李健林 刘志明 单位：广西医科大学第一附属医院普通外科 江西省肿瘤医院病理科