乙型脑炎减毒活疫苗株全长感染性克隆的构建及表达外源基因的初步

时间：2014-12-26 09:45:55 作者：胡兵；杨爽；方志正；

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【摘要】：通过构建乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的全长cDNA克隆,来初步探讨将其作为表达载体的可行性,为下一步利用乙型脑炎病毒作为载体构建嵌合病毒打下基础。利用长片段RT-PCR的方法分两段扩增出乙型脑炎病毒cDNA,通过片段两端的酶切位点,将cDNA依次连接到pACYC184载体。进一步利用分子克隆的手段,在乙型脑炎病毒基因组cDNA的3′非编码区插入增强型绿色荧光蛋白(Ehancedgreenfluorescentportein,EGFP)基因作为报告基因,通过体外转录和转染,拯救乙型脑炎病毒和表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎嵌合病毒。采用RT-PCR、蚀斑实验和荧光显微镜观察等方法对恢复病毒进行鉴定。对恢复病毒进行连续6次细胞传代,从病毒生长特性和结构基因稳定性的角度对恢复病毒传代稳定性进行研究。结果表明成功地扩增并构建得到乙型脑炎病毒的全长cDNA,在此基础上进一步构建得到了乙型脑炎嵌合病毒rJEV-EGFP全长cDNA,经过体外转录和转染获得了活的rJEV病毒及嵌合病毒rJEV-EGFP,并采用了多种方法对其进行了鉴定,拯救出的恢复病毒在已传代的代次内稳定性良好,嵌合病毒rJEV-EGFP可稳定地表达绿色荧光蛋白。本研究应用反向遗传学技术构建并在BHK-21细胞中成功地拯救出了rJEV和rJEV-EGFP活病毒,同时也表明乙型脑炎病毒SA14-14-2株可以作为载体来表达外源基因。
【论文正文预览】：乙型脑炎病毒为黄病毒科,黄病毒属,为单股正链RNA病毒,其基因组全长约11kb,5′端有帽状结构,3′端无PolyA尾巴[1]。病毒编码区形成一个大的开放阅读框(Openreadingframe,ORF),ORF首先编码成一个多聚体蛋白,然后多聚体蛋白在病毒和细胞酶作用下以共翻译或后翻译的方式加工成
【文章分类号】：R392
【稿件关键词】：乙型脑炎病毒反向遗传学全长cDNA感染性克隆表达载体增强型绿色荧光蛋白
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【稿件标题】：乙型脑炎减毒活疫苗株全长感染性克隆的构建及表达外源基因的初步研究
【作者单位】：湖北省疾病预防控制中心传染病防治研究所;武汉生物制品研究所有限责任公司;
【发表期刊期数】：《病毒学报》2014年06期
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