磷是植物生长发育所必需营养元素之一，植物缺磷直接影响植物的生长和作物的产量。目前，我国有74%耕地土壤缺磷。化学磷肥的施加虽然能改善植物磷素营养，但由于磷在土壤中的固定导致磷肥当季利用率较低（黄静等，2010），在我国南方的红、黄壤中缺磷现象更为严重（王同等，2014）。研究表明接种溶磷微生物能提高植物磷素营养（Illmeretal．，1992），但因受到土著微生物、土壤环境等因素的影响，土壤中溶磷微生物难以成功定殖，导致其应用效果不稳定（Reyesetal．，2006；黄静等，2010）。作为植物植株整个微生态系统的重要组成部分，内生菌具有固氮、增强植物抗逆性、抗病虫害及促进植物生长等多种的作用（黄静等，2010）；同时大多数植物内生菌属兼性内生，它们不仅存在于植物体内，也常见于根际土壤等环境（Lodewyckxetal．，2002）。油樟（Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble)N.ChaoexH.W.Li.）为樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）的常绿乔木，也是重要的经济作物，它的根、茎、叶、种子均可作为提取芳香油的原料。调查显示，油樟本身几乎不发生植物病害，亦有研究表明，油樟油对水稻稻瘟病菌等6种植物病原真菌的菌丝生长、孢子萌发有强烈的抑制作用（魏琴等，2006），这些特性可能与内生菌参与构成油樟植株内部微生态环境有关（游玲等，2009）。因此，以油樟为材料，对其组织内的溶磷细菌进行分离筛选，利用内生细菌的兼性特性，既可使这些微生物定殖于植物体内发挥促生和防病效应，也可使其定殖于植物根际土壤中发挥溶磷功能，为植物生长提供有磷素营养，从而促进植物生长。本文以50株油樟内生细菌为材料，筛选具溶磷能力的内生促生细菌，研究其溶磷能力和生物学特性，为植物内生菌在提高植物磷素营养、促进植物生长等方面的利用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
供试菌株为分离自油樟（Cinnamomumlongepaniculatum）组织中的50株内生细菌，于宜宾学院香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室保存。
1.2研究方法
1.2.1油樟内生溶磷菌株筛选（1）内生溶磷菌株初选将供试菌株活化后点接种至固体PKO培养基上，每株菌重复4次，28℃培养7d，观察能否有溶磷圈生成，测定各菌株的溶磷圈直径和菌落直径，分别以D、d表示，根据菌株是否产生溶磷圈初步判定该菌株有无溶磷潜能。（2）油樟内生溶磷菌株摇瓶复选将50mLPKO液体培养基于盛入150mL三角瓶，121℃，1.01P条件高压灭菌25min，备用。将LB斜面培养基上生长24h的供试菌株制成菌数约为108cell.mL-1菌悬液，按菌悬液与培养基1：50比例接种，不接菌作为对照，每株菌重复3次，28℃、160r.min-1摇床培养8d，4℃、10000r.min-1离心15min，取一定量的上清液，测其有效磷含量和pH值，有效磷含量即为菌株的溶磷量。有效磷含量用钼锑抗比色法测定，菌株溶磷量为扣除不接种对照的值(μgP.mL-1)；pH值用酸度计测定。1.2.2油樟内生溶磷菌株分泌IAA能力（1）定性测定：将筛选出的溶磷效果较好的菌株接种于盛有15mLKing液体培养基的试管中，28℃、160r.min-1摇床培养8d，每株菌重复3次。药品选择和配置方法参考李振东等（2010）。分别取各菌株培养液50μL滴置于白色的陶瓷板上，加入50μLPC比色液。以在比色液中加等量50ppm生长素（IAA），不加菌株培养液作为对照。室温条件下15min内观察颜色变化，颜色变为粉红色表示可以分泌IAA，颜色越深表示分泌IAA浓度越大，不变色则表示不能分泌IAA。（2）定量测定：采用Salkowski比色法（Glickmannetal．，1995）：配置2.5mg.mL-1的色氨酸溶液过滤除菌，取1mL加入4mL已高压灭菌的LB液体培养基中，使色氨酸浓度达到0.5mg.mL-1，分别接种各供试菌株，28℃、160r.min-1摇床培养3d，4℃、10000r.min-1离心10min后取上清液1mL，加入50μL的10mmol.L-1正磷酸，加入2mLSalkowski,s显色剂，黑暗条件（25℃）显色30min，测定530nm下的吸光值。以蒸馏水为对照调零，配制不同浓度的IAA作标准曲线，计算培养液的IAA浓度，以μg.mL-1表示。1.2.3油樟内生溶磷菌株产铁载体能力的测定（1）定性筛选：将筛选出的溶磷效果较好的菌株分别接种于铬天青(chromeazuralS，CAS)平板培养基上，28℃培养2d后观察是否有橙红色显色圈出现，并测量显色圈大小。（2）定量测定：将产生橙红色显色圈的菌株分别接种于MKB培养液和富铁培养液中，28℃、160r.min-1摇床培养24h，接种1mL发酵液于MKB和富铁培养液中，28℃、160r.min-1摇床培养36h，4℃、10000r.min-1下离心10min，即可得到铁载体上清液和其无铁载体对照的上清液，备用。取铁载体上清液于洁净的试管中，加入相同体积CAS检测液，充分混匀，于630nm波长下测定吸光值，以As表示，取双蒸水作为对照调零；另取相同体积的富铁培养液（对照液）与CAS检测液反应，于630nm波长下测定吸光值，以Ar表示，计算As与Ar的比值（As/Ar），参照Machucaetal（2003）的标准和方法检测各菌株产铁载体的能力。1.2.4油樟内生溶磷菌株ACC脱氨酶能力的测定(1)定性测定：参考Penroseetal（2003）的方法，分别接种各供试菌株于5mL的无氮液体培养基中，28℃、160r.min-1摇床培养24h；接种上述培养液0.1mL于5mLDF液体培养基中，28℃、160r.min-1摇床培养24h；接种0.1mL培养液于5mLADF液体培养基中，28℃、160r.min-1摇床培养24-48h，以不接种菌株的ADF培养基为对照；将ADF培养基中的生长菌株重复转接和培养3次，能够生长的菌株为ACC脱氨酶阳性菌株。(2)定量测定：参照Selehetal（2001）的方法，每分钟形成1mol丁酮酸的量为1个酶活力单位。采用Bradford法测定蛋白质，标准蛋白为牛血清白蛋白。酶活力的计算参照文献（黄盖等，2013），酶活力用U.mg-1表示。1.2.5油樟内生溶磷菌株产产几丁质酶的测定（1）定性测定：分别接种各供试菌株于几丁质平板培养基上，37℃培养3-5d，观察菌落周围是否有透明圈产生，有则表明该株菌有产几丁质的能力，反之则没有。（2）定量测定：酶活性测定采用DNS法，分别接种各供试菌株于几丁质液体培养基中，28℃、160r.min-1摇床培养8d，4℃、10000r.min-1离心10min，将0.5mL发酵液和0.5mL胶体几丁质混合，37℃水浴30min，煮沸10min，4000r.min-1离心5min。取0.5mL上清液加入0.5mLDNS，煮沸5min迅速冷却后加入蒸馏水4mL，测定540nm下的吸光值。根据N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。一个几丁质酶活力单位定义为：每分钟（37℃）产生1μmolN-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量，以U表示。
2结果与分析
2.1内生溶磷菌株筛选及溶磷能力
通过溶磷圈法对前期分离纯化得到的50株油樟内生细菌进行初筛，发现菌株在PKO固体培养基上产生的透明圈差距较大。如表1所示，培养7d后，D/d>3的细菌有6株（菌株YG43的D/d值最大，为3.84），占供试菌株数量的12%，2.5<D/d<3、2<D/d<2.5和1.5<D/d<2的细菌有分别有11株、7株和15株，其余9株细菌的D/d均小于1.5或者溶磷圈不明显。D/d值是表征菌株相对溶磷能力的一个指标，因此，初步筛选D/d>2的24株细菌通过液体培养研究它们的溶磷能力，另外26个菌株，则侧重研究其它方面的性能。将初选得到的24株菌分别液体培养8d后，测定其上清液可溶性磷含量，由表2可知，菌株对磷酸钙的溶解能力存在较大差异，供试菌株的溶磷量在51.26μg.mL-1-237.08μg.mL-1之间，其中大于200.00μg.mL-1的有2株菌，150μg.mL-1-200μg.mL-1的有4株菌，100μg.mL-1-150μg.mL-1的有10株菌，分别占供试菌株的8.33%，16.67%和41.67%。菌株YG60的溶磷量最大，为237.08μg.mL-1，是溶磷量最小菌株YG33（51.26μg.mL-1）的4.62倍。此外，从各菌株的溶磷能力定性与定量结果可知，对油樟内生菌株而言，并非定性测定的D/d值越大，定量测定的溶磷量就越大，如YY1和YG60的D/d值均大于3，溶磷量却分别为237.08μg.mL-1和61.75μg.mL-1，前者是后者的3.84倍。因此，固体平板培养只可对供试菌株是否具有溶磷能力作初步定性判断，而液体培养测定的菌株溶磷能力在理论上更准确。此外，各菌株在PKO培养基上生长8d后，其培养液的pH值均较接种前明显下降，各菌株培养液的pH值介于4.5-5.5，下降最大的为YG9，pH值下降为4.4。为进一步发掘油樟溶磷内生菌的功能，选择溶磷量大于150μg.mL-1的6株菌（分别为：YG60、YG43、YG36、YG25、YG49、YG44）研究其生物学特性。
2.2内生菌分泌IAA性能分析
油樟内生细菌分泌IAA能力的定性显色反应结果表明（表3），6株供试菌株不但具有较高的溶解难溶性磷的能力，同时均具有分泌生长素的功能，YG43的显色反应为深红色，YG60、YG25和YG44菌株呈粉红色，YG49和YG36呈浅粉红色。定量测定结果表明各菌株分泌IAA量在4.92μg.mL-1-22.55μg.mL-1之间，其中分泌IAA量超过20μg.mL-1的有1株（YG43，22.55μg.mL-1），超过10μg.mL-1的有2株（YG60、YG25，IAA分泌量分别为18.75μg.mL-1和16.41μg.mL-1），其余3株的IAA分泌量均低于10μg.mL-1，定量测定与定性测定结果相对一致。
2.3内生菌产铁载体能力分析
将6株油樟内生细菌接种于CAS平板上培养2d后，检测到除YG49之外的其它5菌株（YG43、YG60、YG25、YG44、YG36）的菌落周围均出现橙黄色晕圈，说明这些菌株在CAS培养基上产生了铁载体，其中YG43、YG60和YG25菌落周围形成的橙红色晕圈较大，表明这3株菌能够产生较多的铁载体。定量检测铁载体的方法以As与Ar的比值（As/Ar，Ar为对照吸光值）大小比较不同菌株产生铁载体的能力，As/Ar值越小，说明菌株产铁载体的能力越强。由表3可知，YG43和YG60的As/Ar值小于0.6，分别为0.579和0.458，说明这2株菌产生铁载体的能力较强；YG25的As/Ar值为0.694，说明产铁载体的能力中等；YG44和YG36的As/Ar值均大于0.8，说明这2株菌能产生铁载体，但产铁载体能力较弱。
2.4内生菌产脱氨酶（ACC）能力分析
将溶磷能力较高的6株油樟内生细菌接种于SMA固体培养基后的ACC脱氨酶活性定性筛选实验结果表明（表3），经5次传代后YG49不能正常生长，其它5株菌（YG60、YG43、YG36、YG25、YG44）均能够在SMA固体培养基上正常生长，说明除YG49外，其它菌株都具有ACC脱氨酶活性。定量检测结果显示（表3），各菌株的ACC脱氨酶活性大小顺序为YG60>YG25>YG43>YG36>YG44，酶活大小介于0.052U.mg-1-0.224U.mg-1；YG49无产ACC脱氨酶能力。
2.5内生菌产几丁质酶能力
将6株油樟内生溶磷细菌接种于产几丁质酶的固体平板上培养7d，发现均有明显的透明圈产生，说明供试菌株皆有一定的产几丁质酶的能力，但各菌株的透明圈差异较大，透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）介于1.59-3.12。通过液体培养定量测定供试菌株的几丁质酶活性的结果表明（表4），各菌株的几丁质酶活性大小顺序为YG60>YG25>YG43>YG36>YG44>YG49，酶活大小介于0.618U.mg-1-2.968U.mg-1。
3讨论
植物内生细菌因其对宿主的多种有益的生物学作用，逐渐成为国内外学者研究的热点。作为我国特有的天然芳香油生产植物，可经高温蒸馏从油樟（Cinnamomumlongepaniculatum）叶片中提取几十种不同沸点的化学物质，这些物质精加工后的产物均是国防、医药、轻工等方面重要的稀有原料。具有溶磷能力的油樟内生促生细菌的筛选及促生、抗逆等生物学特性的研究，对溶磷微生物资源收集，植物内生细菌与宿主相互作用机制的理解及土壤磷素营养改善途径的开发都具有重要意义（黄静等，2010）。本研究从油樟内生细菌中初筛到24株具有溶磷潜能的菌株，液体培养结果显示，溶磷量大于200.00μg.mL-1的菌株有2株，150μg.mL-1-200μg.mL-1的菌株有4株，黄静等（2010）从玉米叶中分离的内生细菌溶磷量高达537.6μg.mL-1，姚玉玲等（2014）从矮生嵩草中分离的内生细菌溶磷量为60.52μg.mL-1，说明油樟内生细菌对无机磷的溶解能力较强。微生物在溶磷过程中会分泌如甲酸、草酸、苹果酸等在内的各类有机酸，这些酸类物质既可降低培养基质的pH又能与钙、铁、铝等离子形成螯合物从而使难溶性磷酸盐溶解（Rashidetal．，2004）。本研究中24株菌在PKO培养基上生长8d后，其培养液的pH值较接种前均有明显下降，但菌株溶磷量与培养液pH值之间无显著线性关系（p>0.05）。表明内生溶磷细菌在培养期间，介质的酸度有一定降低，但培养液中的有机酸含量及种类、磷酸酶活性及产生多糖等的动态变化，均会对菌株的溶磷能力产生影响（李显刚等，2012）。植物内生菌可通过自身合成或者促进植物合成如生长素(IAA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTKs)、脱落酸(ABA)和乙烯等植物生长激素促进植物体的生长发育，其中生长素(IAA)是最活跃的成分（杨波等，2013）。一定浓度的IAA既可直接促进植物生长，又能通过增加细胞的体积和质量、改变细胞的内环境达到促生的目的（李显刚等，2012）。本研究发现，6株溶磷能力较强的油樟内生细菌均具有分泌生长素的功能，且3株分泌IAA的能力较强（YG43、YG60和YG25），这一结果对油樟内生细菌作为促生菌促进植物生长开辟了新的途径。铁载体的产生是植物内生细菌促进宿主生长发育的另一条重要途径，植物内生微生物或者植物根际通过分泌产生多种对铁具有高亲和力的铁载体，铁载体可将Fe+3还原为植物体可以高效吸收和利用的Fe+2，溶解和结合土壤中的铁元素供植物细胞利用；同时微生物产生的铁载体通过与植物根际的病原微生物争夺有限的铁营养，抑制病原微生物的生长和繁殖，从而起到生物防治作用（Buyeretal．，1993）。目前还无可作为各类微生物铁载体的标品用于其标准曲线的测定，因此，国际上通用As/Ar值作为微生物铁载体定量检测的指标（何苗等，2011）。本研究中，5株油樟内生细菌能够产生铁载体，且YG43和YG60的As/Ar值小于0.6，产铁载体的能力较强。因此，产铁载体可能是油樟内生细菌的促生机理之一。ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶是许多植物促生细菌（Plantgrowthpromotingbacteria，PGPB）共有的一个特征性酶，具有该种酶活性的内生细菌和植物根际对促进植物生长发育、提高植物抗高低温、盐、旱、涝、及重金属等各种胁迫起到重要作用（Iniguezetal．，2004）。黄盖等（2013）从苜蓿根际分离的ACC30菌株的酶活力为0.217U.mg-1，该菌株能够促进苜蓿根的伸长。本研究中除YG49外，其它5株菌均具有ACC脱氨酶活性，且YG49、YG60和YG25的酶活力在0.2U.mg-1左右。因此，油樟内生细菌具有极大的促生、抗逆潜能。几丁质酶水解真菌细胞壁几丁质产生的中间产物几丁寡糖可以作为植物功能调节剂，刺激植物生长，诱导植物产生防御反应，从而提高植物的抗病性（郭玉莲，2005）。此外，几丁质酶与β-1,3-葡聚糖酶、其它PRP等防卫蛋白存在协同作用，可以增大作用范围，从而提高抑菌效果。本研究中的6株油樟内生细菌皆有较高的产几丁质酶的能力，酶活大小介于0.618U.mg-1-2.968U.mg-1，这些内生细菌产生的几丁质酶对植物病虫卵的入侵和感染起到重要的防治作用（Barboza-Coronaetal．，2009），这也可能是油樟生长中几乎不发生植物病、虫害的原因之一。研究表明，真菌和细菌的几丁质酶活性最高，细菌对真菌的抑制作用上最强（陈三凤等，1994），因此，本研究可丰富几丁质酶产生菌及生防菌资源。通过溶磷圈法和液体培养法从50株油樟内生细菌中筛选到6株（YG60、YG43、YG36、YG25、YG49、YG44）溶磷能力较强的菌株，综合各菌株的溶磷、促生和抗逆性能，认为YG43、YG60和YG25菌株在促进植物生长、提高植物抗性及生物防治方面具有较好的应用前景。
作者：冯瑞章 周诰均 魏琴 周万海 范轶玲 秦欢 单位：宜宾学院生命科学与食品工程学院 香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室