1MDM2在小鼠大脑皮层神经元发育过程中表达分布
我们分别选取发育正常的出生后2天、4天、7天、3周、2月、3月、6月、10月龄的昆明小鼠各4只，提取大脑皮层组织的蛋白样品，采用针对MDM2的抗体MDM2(SMP14)来检测不同发育阶段MDM2的蛋白表达。Westernblot结果(图1A)显示，出生后2天至3周MDM2的蛋白表达量逐渐增加，以后量逐渐降低(图1B所示，P<0.05或P<0.01)。免疫组织化学染色结果显示MDM2蛋白在大脑皮层的表达变化趋势基本与免疫印迹结果一致(图1A，C)。另外，从MDM2的分布来看，在小鼠出生后早期2~7天(图1C)，大脑皮层神经元细胞核部位MDM2染色很浅，胞浆中呈现较均匀的染色，在7天的小鼠偶尔可见MDM2在神经元突起中富集。而3周龄小鼠，除MDM2染色加深外，尤其值得注意的是在接近神经元的部位出现尾状的MDM2富集，通常为粗端指向脑表面，细端指向皮层深部。在2月龄和6月龄时，MDM2染色减弱，这种尾状的强阳性染色也有所缩短。这种尾状的形态我们推测可能是AIS，因为它们的分布与树突标志蛋白MAP2[11]呈不同的分布方向(图1E)。积分光密度(IOD)分析显示，与3周龄小鼠MDM2在神经元AIS的分布相比，2和6月龄时MDM2在AIS的分布减少(图1D)。
2MDM2在小鼠大脑海马神经元发育过程中表达分布
用MAP2和MDM2抗体进行荧光免疫双标染色，观察MDM2在海马CA1区的分布趋势。结果(图2A)显示出生后2天和7天(未在文章中展示)小鼠MDM2在海马CA1区大量表达，呈现均匀地在海马的缘层(stratumoriens,SO)和放射层(stratumradiatum,SR)分布，仅偶尔可见类似AIS的富集，这时MAP2也还没有出现明显的极性分布，呈现均匀的分布。这与发育过程中MDM2在大脑皮层的分布变化趋势类似。3周时可观察到MDM2在海马CA1区神经元AIS部位呈高密度分布，细端指向SO；而同时MAP2也开始呈现极性分布，即主要在SR分布。2个月时MDM2在CA1区海马神经元AIS的分布与3周时相比减少(P<0.001)。而与皮层所不同的是，6个月时MDM2在海马CA1区神经元AIS的分布较2个月时增加(P<0.05)(图2B所示)。选取发育正常的出生后2天至10个月龄的昆明小鼠，提取海马组织的蛋白样品，免疫印迹检测MDM2的蛋白表达。图2C结果显示，在出生后2天至3周MDM2的蛋白表达量较高，2个月时MDM2的蛋白表达量与2天时相比显著降低(P<0.01)，但随着成熟与老化的进展，6、10月时MDM2蛋白表达量较2个月时增加(P<0.01)(图2D所示)。
3MDM2定位表达于正常成年大鼠大脑神经元AIS
上述研究提示MDM2在成年昆明小鼠大脑皮层和海马神经元的AIS部位分布，但尚不清楚这种分布是否与特定的动物有关。因此我们采用免疫组化方法对正常成年SD大鼠不同脑组织结构进行观察。结果显示MDM2在SD大鼠的大脑皮层(图3A)、纹状体(图3B)以及海马的CA1区和齿状回(图3C和D)都存在AIS部位高密度特异性分布。这说明在不同类型的啮齿动物都可出现AIS中富集MDM2，并且在不同脑区的神经元也都具有AIS中富集MDM2的特点。AIS是从近神经元胞体的神经轴丘起至髓鞘开始出现包绕为止的一段无髓鞘结构，长约10~60μm[12]。我们上述的研究提示MDM2可在成熟神经元的AIS特异分布。为了进一步明确MDM2与AIS的关系，我们检测了神经元AIS区标志蛋白AnkG和Nav1.6表达与MDM2分布的关系。免疫荧光双标结果显示MDM2的表达与AnkG、Nav1.6的表达分布位置一致，共同定位于神经元AIS(图3E，F)。我们在体外原代培养的皮层神经元上进一步观察MDM2在AIS部位的分布情况。结果显示，在正常的原代培养神经元上，MDM2与MAP2形成相对的差异分布，MDM2主要在轴突中分布，而MAP2在胞体和树突部位有大量分布(图3G)。其次，我们观察到在原代培养的皮层神经元AIS部分MDM2与AIS标志蛋白Nav1.6及AnkG有共定位(图3H，I)。已知在神经元AIS内的蛋白呈致密的分布，皂素处理情况下其分布稳定，因此，我们对原代培养的神经元采用皂素预处理，进一步的免疫荧光染色仍然可以观察到AIS样分布的MDM2(如图3J所示)，提示MDM2具有类似AIS蛋白的生化特性。
4Nutlin-3对海马神经元MDM2、Nav1.6和MAP2分布的影响
为了研究MDM2在大鼠神经元的功能，我们向大鼠海马内注射MDM2的抑制剂Nutlin-3，并以注射生理盐水组作为对照。免疫组化染色显示海马内注射MDM2抑制剂Nutlin-312h与24h后，MDM2在AIS的分布明显减少(图4A)。Nav1.6是在神经元AIS高密度分布的一种离子通道蛋白，其蛋白表达量与动作电位的产生密切相关。大鼠海马内注射Nutlin-3后，Nav1.6在AIS的分布也明显减少(图4B)。MAP2在对照动物海马CA1区神经元的胞体及在放射层的树突可见免疫荧光阳性染色(图4C中黑色箭头所示)，而缘层方向的轴突部分中未见免疫阳性着色。在海马内注射MDM2抑制剂Nutlin-3后12h可观察到MAP2在海马缘层方向神经元轴突中有明显分布增加(图4C中白色箭头所示)，这一结果提示MDM2影响MAP2在神经元的极性分布。另外，我们观察到海马注射Nutlin-3后，MAP2在神经元的极性分布改变伴随活化型Caspase-3染色有所增加(图5)。
5讨论
一般认为MDM2是p53负反馈调节环中的重要因子，当MDM2过表达或活性增强时，阻断p53蛋白的转录激活，p53功能抑制或失活，导致细胞异常增生，促进细胞癌变[3,5]。此外，近期的研究还发现MDM2还可正反馈调控p53表达[13]。近年来，MDM2调控中枢神经系统的分化发育及神经细胞生理活动方面的研究也逐渐增加。已有研究表明巢蛋白Cre重组酶介导的中枢神经条件敲除MDM2小鼠出现大脑皮层脑室区和中间区广泛的p53依赖的细胞凋亡，导致神经上皮变性和脑积水以及小鼠围产期死亡[14,15]。利用新型亚效等位基因MDM2puro/Δ7-9小鼠研究发现，该小鼠中枢神经系统发育过程中MDM2表达量仅为野生型的30%，造成全脑发育不良，脑容量明显小于野生型动物；并发现小脑颗粒神经元前体p53介导的细胞凋亡水平升高[16]。MDM2不仅在胚胎期大脑神经元的分化发育中起着重要作用，而且在成熟大脑神经元的生理、病理过程中起重要作用。有文献报道MDM2可与β-arrestin结合[17]。MDM2通过它的E3连接酶活性来调节arrestin依赖的G蛋白偶联信号传导和细胞膜受体的运输，表明MDM2可能在大脑信号传导过程中发挥作用[18,19]。此外，在脑缺血及药物急性成瘾后MDM2在大脑中的表达改变，表明MDM2在大脑病理生理过程中发挥重要作用[8,9]。然而，在成熟神经元MDM2的表达分布及其生理功能目前尚不清楚。为此，我们检测了MDM2在脑内的表达和分布。在小鼠出生后的脑的发育过程中，大脑皮层和海马内MDM2表达的模式并不相同，但是它们在分布上有一个共同的特点就是在7天以后，MDM2向AIS富集。在成年大鼠大脑内，MDM2广泛表达于大脑皮层、海马、纹状体及小脑(结果未显示)等部位的神经元内，且呈AIS样分布。这提示了MDM2在不同的脑区的功能可能存在差异，但是它们可能都参与AIS的成熟和功能维持。AIS是轴突起始的无髓鞘结构[12]，密集分布着电压门控的离子通道、特殊类型的细胞黏附分子、聚集的肌动蛋白、特化的细胞骨架蛋白和脚手架蛋白等[12,20,21]。AIS是神经元产生动作电位的主要部位，也是神经元整合输入信号、调节和确定信号输出的关键部位[12]。在功能上，AIS还具有控制神经元内功能和结构蛋白的极性分布，向细胞核发送信号调节神经元基因表达等功能[20]。至今仍有新的蛋白组构及其调控机制不断被发现。AIS的蛋白组构十分复杂，目前已知Nav1.6是在AIS高密度分布的离子通道蛋白，对动作电位的产生起着至关重要的作用[22]，而AnkG被认为是AIS保持离子通道聚集和控制神经元极性的必需骨架蛋白，是AIS的一个标记蛋白[23,24]。为了进一步明确MDM2否定位于神经元AIS区，我们采用了荧光免疫双标记法进行研究。结果显示在正常SD大鼠皮层神经元内MDM2的分布与AIS的标记蛋白AnkG、Nav1.6的分布相一致。由此证实MDM2在AIS区呈特异性高密度分布。众所周知，神经元的发育并未随着出生而停止，而是随着出生后机体生长发育而日趋成熟，呈现动态过程。既往研究表明在恒河猴大脑外皮层内AnkG在AIS的密度出生时迅速达到最大，随后进行性降低直至4岁左右开始维持相对稳定的水平至成年。βIV-spectrin在AIS的密度同样在出生时迅速达到最大，而后进行性下降至出生后5个月左右相对稳定至成年。而据Bhat等报道，在出生后10天的小鼠蒲肯野神经元AIS部位可观察到AnkG、Nav1.6，在出生后20天时AnkG、Nav1.6在蒲肯野神经元AIS高密度富集[25]。
我们的研究结果显示昆明小鼠在出生7天后，大脑皮层MDM2逐渐向AIS分布，在21天时可明显观察到MDM2已在大脑皮层神经元AIS部位高密度表达，以后MDM2在AIS的分布密度降低。可见MDM2在昆明小鼠大脑皮层及海马神经元AIS的分布密度同样存在一个年龄相关性的动态变化。而我们观察到MDM2在小鼠大脑皮层及海马神经元AIS部位的出现时间与Bhat等报道的AnkG、Nav1.6在蒲肯野神经元AIS部位的出现时间接近，我们推测MDM2在神经元AIS的形成和稳定期起调节作用。MDM2除本实验显示的在AIS上的分布外，也有报道MDM2在突触后通过对PSD-95的泛素化修饰介导神经可塑性机制[26,27]，并可调节神经突起的生长[28]。我们观察到的动物出生后不同时程MDM2在皮层与海马表达的动态变化呈现不同的模式，这是否因为海马与皮层神经元在发育和老化的过程中神经可塑性的变化及其机制存在差异，需要进一步研究。Nutlin-3是MDM2的一种小分子抑制剂，它通过与MDM2结合可抑制MDM2与p53之间的相互作用，导致p53的稳定以及激活p53信号通路，常在治疗肿瘤中发挥抗肿瘤作用[29]。我们的免疫荧光结果显示Nav1.6在MDM2被Nutlin-3抑制后的AIS部位表达明显下调，表明MDM2对维持Nav1.6在AIS的高密度分布起着重要作用。而既往研究发现敲除AnkG后，Na+通道蛋白将从AIS脱失，由此我们推测MDM2可能与AnkG一起共同发挥作用，维持了Nav1.6在AIS的高密度分布。
MDM2在神经元AIS的富集可能也与AnkG关联。因为一种含有7个Ankyrin序列的蛋白Gankyrin，在肿瘤中可与MDM2的结合而调节MDM2的功能[30]。在正常神经元的AIS，富集的MDM2蛋白是否参与了脑疾病中AIS的可塑性改变和结构异常的机制[31,32]尚待进一步研究。既往研究表明AIS在神经元极性的维持中起关键作用。AIS中高密度分布的膜蛋白和结构蛋白可能形成了一个分子筛，能够阻止脂质和其它蛋白的自由扩散，从而将轴突、树突蛋白分选定位到相应位置[33,34]。MAP2是一种微管相关蛋白，主要在胞体和树突表达。当神经元AIS逐步形成时，MAP2便开始被排斥在轴突外。AnkG是一种在神经元AIS定位的接头蛋白(adaptor)，对AIS的蛋白分布定位有非常重要的调节作用[24,35]，对神经元极性的维持起着必不可少的作用。如果AnkG表达抑制，MAP2可随之由胞体树突向轴突分布。海马CA1区的锥体神经元绝大部分向放射层伸出树突，而向缘层伸出轴突。我们的结果显示，在SD大鼠海马内注射Nutlin-3后使MDM2在海马神经元内的分布发生改变，同时海马神经元轴突延伸方向可观察到树突标记蛋白MAP2的表达。Nutlin-3抑制MDM2功能，会导致p53活性增加。Nutlin-3海马内注射，是否会由于神经元损伤导致MAP2的分布发生改变。为了探索这个问题，我们进行了活化型Caspase-3和细胞核固缩的观察。结果显示，海马内注射Nutlin-3的动物，海马内MAP2极性分布的改变伴随活化型Caspase-3有所增加。这提示神经元损伤后产生的间接效应，可能也部分参与了Nutlin-3对神经元蛋白极性分布的影响。综上所述，MDM2蛋白随脑神经元的发育逐渐在神经元AIS富集表达，其功能可能国内医学期刊涉及调节AIS的功能和神经元极性的维持。
作者：赵红 王丹丹 许玉霞 朱粹青 单位：复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室