１真核表达质粒ｐＥＧＦＰ－ＦＨＩＴ的鉴定
对所构建的质粒进行ＰＣＲ检测，ＰＣＲ扩增出４８０ｂｐ片段；内切酶图谱鉴定。酶切结果显示：４８０ｂｐＦＨＩＴ和４ｋｂ两条片段（图１）；序列分析：ＤＮＡ测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ比较，核酸序列一致。
２ｐＥＧＦＰ－ＦＨＩＴ转染ＨＬ６０细胞
转染４８ｈ后实验组ｐＥＧＦＰ－ＦＨＩＴ／ＨＬ６０（图中命名为ｐＦＨＩＴ组）及对照组ｐＥＧＦＰ／ＨＬ６０（图中命名为Ｃｏｎｔｒｏｌ组）用荧光显微镜观察，均见绿色荧光蛋白表达，两组绿色荧光强度无明显差异，空白对照组（图中命名为Ｗｉｌｄｔｙｐｅ组）ＨＬ６０无荧光表达（图２）。实验组计算载体转染率为４０％。
３ＲＴ－ＰＣＲ检测ＦＨＩＴｍＲＮＡ的表达
转染后２４ｈ，进行ＦＨＩＴ基因的ＰＣＲ扩增，扩增产物为４８０ｂｐ，实验组（ｐＦＨＩＴ）显示明显亮度的条带，与对照组相比，说明转染成功，β－ａｃｔｉｎ作为内对照（图３）。
４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＦＨＩＴ蛋白的表达
转染后４８ｈ，进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验，实验组显示产物蛋白为１６．８ｋＤ，与目的基因ＦＨＩＴ蛋白大小一致，β－ａｃｔｉｎ作为内对照（图４）。
５ＭＴＴ检测细胞增殖情况
转染ＦＨＩＴ基因后，实验组细胞增殖抑制率６天分别为８％、２５％、４１％、６２％、７０％、７５％，与对照组相比具有显著性差异（Ｐ＜０．０５，图５）。
６流式细胞仪检测细胞凋亡
转染４８ｈ进行流式细胞仪检测，结果显示：实验组凋亡指数高于对照组。实验组凋亡率（２５．２５±０．２７）％，与对照组凋亡率（５．３１±０．３１）％相比，具有统计学意义（Ｐ＜０．０５，图６）。
７讨论
急性白血病是致死率高的恶性肿瘤之一，急性髓系白血病（ａｃｕｔｅｍｅｏｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＭＬ）在我国最为多见。目前，联合化疗依然是ＡＭＬ最基础和主要的治疗手段，但大部分患者仍旧复发，超过７０％的患者最终死亡。随着生物技术的发展，基因治疗迅猛发展。肿瘤的发生往往与体内基因的异常表达密切相关，ＦＨＩＴ基因在急性髓系白血病中的异常表达为白血病的基因治疗提供了可能。ＦＨＩＴ基因位于染色体３ｐ１４．２区域内，外显子５－９开放性阅读框编码一个由１４７个氨基酸组成的相对分子质量为１６８００的蛋白即ＦＨＩＴ蛋白。ＦＨＩＴ基因几乎存在于所有正常组织，主要通过参与细胞周期的调控和凋亡发挥作用，可使细胞受阻于增殖周期的Ｓ期，并激活Ｃａｓｐａｓｅｓ８和Ｃａｓｐａｓｅｓ９从而引起Ｃａｓｐａｓｅ酶介导的凋亡级联反应［４］。ＦＨＩＴ基因位于人类基因组最常见脆性位点，其基因异常与许多肿瘤有关，是肿瘤发生发展过程中的早期事件［５－６］。ＦＨＩＴ在人体肿瘤中主要的异常形式是杂合性缺失（ｌｏｓｓｏｆｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ，ＬＯＨ）和ＦＨＩＴ蛋白表达的减少或缺失［７］。白血病中也存在ＦＨＩＴ基因的转录异常和ＦＨＩＴ蛋白的缺失或低表达［１］，但ＦＨＩＴ在白血病发生发展中的作用机制还不很清楚。我们首先克隆ＦＨＩＴ基因，成功构建了ｐＥＧＦ／ＦＨＩＴ真核表达载体，经测序鉴定后成功转染到ＦＨＩＴ基因异常表达的急性髓系白血病细胞系ＨＬ６０中，转染４８ｈ后荧光显微镜下见绿色荧光表达，表明载体转染成功。转染后细胞的ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ进一步证明了ＦＨＩＴ基因成功转染ＨＬ６０细胞，并能够进行表达，ＭＴＴ实验显示转染的ＦＨＩＴ基因能显著抑制白血病细胞ＨＬ６０的细胞增殖，流式细胞术实验表明ＦＨＩＴ的转染能显著诱导肿瘤细胞的凋亡，提示ＦＨＩＴ基因表达的改变可能在白血病的发生发展中扮演着重要的角色，为白血病基因治疗的相关研究奠定了基础。有研究显示ＦＨＩＴ表达的缺陷可以用于预测非小细胞肺癌患者的复发及预后［８］。有研究显示ＦＨＩＴ基因表达异常可以作为膀胱恶性肿瘤的诊断依据［９］。ＣｈｅｎＸ［１０］等研究显示对ＦＨＩＴ表达的检测可以为临床鼻咽癌的诊断及治疗提供非常有价值的信息。本实验显示：ＦＨＩＴ基因可以抑制ＦＨＩＴ表达缺陷的白血病细胞ＨＬ６０的增殖并诱导其凋亡，因此ＦＨＩＴ表达的缺失可能与白血病的发生发展相关，为白血病发生机制的研究奠定了基础。在今后的实验中尚需进一步明确ＦＨＩＴ基因抑制细胞生长和促使细胞凋亡的机制，以期为ＦＨＩＴ的基因治疗奠定基础。
作者：周永莉 牛春燕 刘凯歌 高保华 李雷