１细胞培养罐
动物细胞培养罐一直在研究和开发中，动物细胞体外培养对生长基质依赖性可区分为贴壁培养类细胞，需要在反应器中加入微载体辅助其快速生长；另一类为非贴壁依赖性细胞，大多数细胞属于这类，它们可以像微生物一样在机械搅拌反应器中悬浮培养生长，但搅拌桨叶应具备低剪切和良好的混合特性，新型桨叶形状类似大象耳朵的ＥｌｅｐｈａｎｔＥａｒ桨，现在被广泛应用于动物细胞悬浮培养反应器中。赵晓伟［１１］结合ＣＦＤ数值模拟方法分析ＥｌｅｐｈａｎｔＥａｒ桨与其他３种常用搅拌桨叶在流场传质性能及剪切大小进行仿真对比，得出该桨叶综合了轴流桨和径流桨的优点，流场分布均匀，并产生的剪切较小，能适用于大规模动物细胞反应器。ＡｌｖｉｎＷ等［１２］应用ＰＩＶ试验研究了ＥｌｅｐｈａｎｔＥａｒ桨在不通气与不同通气量情况所产生的流场，在高速相机拍下的液体运动轨迹图像证明了该桨具有良好的混合性能，另外流场中的湍动能比较小，即对细胞造成的损伤小。
２细胞截留装置
细胞截留装置有重力沉降、旋转过滤、中空纤维、离心和超声波这几种系统［１３］，各种系统需满足下列要求：①细胞截留效率高而且稳定；②能够长期使用；③截留装置必须干净、无菌、可重复利用；④对培养基使用寿命和细胞损伤要小［１４］。动物细胞悬浮培养的灌注系统主要采用重力沉降或者旋转过滤器做为截留装置。倾斜式重力沉降装置有结构简单、无堵塞、对细胞剪切小、成本低等优点。但是普遍存在细胞团大量黏附于沉降器下底面导致细胞在其他负增长空间平均停留时间过长，产物表达能力与细胞活性下降等问题，最终影响灌注培养系统的效率，这也决定了它不可能用于大规模生产。张璐等［１５］针对细胞中重力沉降装置细胞黏附的问题，采取表面硅化对装置底面材料进行改性，并且在不改变重力沉降装置原有优势的条件下降低细胞在底面的黏附量，以改善其细胞截留性能，整个灌注培养体系的运行效率得以提高。以旋转过滤器为截留装置的灌注系统已成为动物细胞悬浮培养主流模式。一般小型反应器旋转过滤器和搅拌桨叶在同一轴上，旋转壁面上分布各个筛孔，一般筛孔大小为２０μｍ～５０μｍ，具体筛孔大小需要针对所培养细胞大小对应设计，可以根据显微技术分析细胞大小，选择合适筛网孔径（略大于细胞颗粒），从而使培养基和细胞碎片从筛面通过，大部分活细胞位于筛面外而被截留下来。但由于长时间高密度培养细胞容易结团，再有旋转过程产生的离心力，细胞团会黏附在筛面上，即旋转过滤器会出现堵塞问题。尽量避免这种问题的途径是选择好合适孔径的同时，筛网材料选择也很重要，不锈钢加特氟龙表面就有很好的防黏效果［１６］；还有培养过程中要控制合理的搅拌转速。ＤｅｏＹＭ等［１７］发现高的转速可使旋转过滤器免于堵塞，无堵塞下的最大灌注速率与筛网表面的切向速度的平方相关。总之，通过蠕动泵调节设置适当的灌注速率，争对细胞培养工艺设置最佳转速，能保证旋转过滤器无堵塞情况，从而充分发挥灌注培养系统优势。
３动物细胞灌注培养应用
３．１在组织工程上应用
周焕城［１８］在美国航空航天局设计的５００ｍＬ新型旋转灌注微重力生物反应器（ＲＣＭＷ）的基础上，通过内芯循环模式优化方法与改造，设计成由新鲜培养基槽、流变控制器、蠕动泵系统、细胞培养反应器、膜肺和供气系统组成的新型双向旋转灌注微重力生物反应器，并将人肝细胞（ＣＬ－１）在３种反应器（ＲＣＭＷ组、ＲＣＭＷ高氧组和双向反应器组）中加入微载体培养７ｄ，对比３组肝细胞活力、数量和功能差异，表明新型双向反应器组能大大提高体外培养人肝细胞的活率和功能，有望为肝脏移植手术提供重要资源。张宇等［１９］设计一种由储液瓶、真空泵、蠕动泵和灌注室组成的灌注系统，专用构建β－磷酸三钙组织工程骨。灌注室用材料色素洗脱后，分静态、常压灌注和间断低压环境３次试验培养骨髓间充质细胞４周，期间采集数据关于葡萄糖消耗量、细胞活力、骨桥蛋白水平和碱性磷酸酶比活性，结果表明间断性低压环境的灌注反应器中细胞分化效率高，葡萄糖消耗量少，该反应器高效的促进细胞增殖效应可减少初始复合的种子细胞数量，适合于长节段、大体积组织工程骨的快速构建。曾造等［２０］设计了可显压力的细胞灌注培养装置，该系统用恒温水浴锅控制温度，用Ｕ型压差计检测压力，用蠕动泵调节灌注速率，用核磁共振（ＮＭＲ）管在线检测细胞活率，初步灌注培养乳腺癌细胞，定期观察细胞活率及无菌情况，五天后仍有细胞存活，且无细菌生长，即该装置能在线培养乳腺癌细胞上百小时，并为细胞灌注方法与核磁共振试验连用打下基础。迟占有等［２１］将自主设计的造血细胞重力沉降截留系统结合机械搅拌反应器灌注培养脐血造血细胞（ＣＦＵ－Ｍｉｘ），通过两次灌注试验表明，与方瓶中ＣＦＵ－Ｍｉｘ的扩增相比，反应器灌注培养中ＣＦＵ－Ｍｉｘ的扩增有很大优势，在６ｄ～７ｄ方瓶扩增倍数达到最大，而反应器一直到１２ｄ左右达到最大。搅拌式反应器灌注培养得到的细胞中干／祖细胞含量较高，培养规模达到了临床要求，但过高的细胞密度将对造血细胞的生长产生抑制。
３．２在疫苗和单克隆抗体上应用
传统转瓶制备疫苗显现出生产效率低、能耗高等不足，郑朝朝等［２２］对猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）培养工艺进行优化探索后，应用于１００Ｌ激流灌注式反应器培养Ｍａｒｃ－１４５细胞，接种ＰＲＲＳＶＲ９８株进行病毒培养，培养６ｄ细胞数量可增殖５倍～７倍，单次病毒收获量相当于３０００个～５０００个１０Ｌ转瓶，为规模化制备疫苗提供了技术参数。Ｖｅｒｏ细胞广泛应用于疫苗生产，宋羚羚等［２３］采用外循环式细胞载体灌注培养工艺，桨载体培养袋固定于反应器外，通过蠕动泵及重力作用实现培养液供给细胞正常生长代谢所需养分，同时用ＮＢＳ公司ＣｅｌｌＧｅｎ３１０酯片为微载体培养Ｖｅｒｏ细胞，培养８ｄ后通过电镜观察酯片上细胞数量，表明１个ＡＰ２００纸片载体灌注系统的细胞量相当于１２００个大转瓶的生产车间，而ＡＰ１２００拥有７２００ｇ细胞载体量，极大地提高了培养效率。单克隆抗体（ｍＡｂｓ）生产在分批培养和流加培养操作取得成功，但往往培养时间比较短并且所培养细胞系浓度不高，ＬｅｃｉｎａＭ等［２４］基于流化床反应器灌注培养ＫＢ２６．５细胞，所用ＤＭＥＭ培养基加有海藻酸钙微胶囊，用来生产免疫球蛋白ＩｇＧ３，ＫＢ２６．５细胞密度达到１．０５×１０８个／ｍＬ，并且连续灌注培养３５ｄ，这与分批培养和流加培养相比，大大提高了生产周期。谢波等［２５］用外置旋转过滤器及新型简便式激流式反应器（一次性培养袋）灌注培养３种贴壁细胞（ＭＫＣＫ，ＶＥＲＯ和ＤＦ－１）和３种经无血清悬浮驯化的细胞（ＣＨＯ，ＢＨＫ－２１和Ｓｆ９），贴壁细胞系采用纸片转管反应器逐级扩培，悬浮细胞系用锥底摇瓶反应器逐级扩培，在优化激流式反应器多种操作条件后，通过初始接种密度与后期最高培养密度对比，达到高密度灌注培养要求，建立了相应动物细胞５Ｌ～１０Ｌ规模的培养工艺。
４结论与展望
灌注式生物反应器通过蠕动泵不断泵入新鲜培养基，排出代谢废产物，经同灌注速率调节可使营养物质和代谢废产物与细胞之间的物质传递、种子细胞及生物材料结构截留及干预，但这也提高了成本，并且在一定程度上影响了材料本身的力学特性，不具备普适性。ＳｐｙｒｏｓＩ等［２６］运用新陈代谢组学分析方法辅助分析细胞灌注培养过程中细胞的实时生长情况，更有助于调控相应细胞的灌注培养操作参数，这为完善灌注培养系统提出的新技术指导。灌注的方法不仅可以用于培养细胞还可以用于药物等方面的研究［２７］。灌注培养可实现细胞高密度培养，对于高密度细胞群所需耗氧量也随着增加，一方面要不断优化细胞培养工艺，灌注培养的培养周期长，这加大了培养基用量与成本，开发无血清成本适宜的培养基非常关键；另一方面动物细胞反应器内搅拌装置也在不断改善，即能实现良好的混合和分散溶氧效果好，又能减小桨叶和气泡给细胞带来的剪切损伤，这一直是动物细胞反应器设计的难点。灌注培养将成为细胞培养的主流模式，为生物制药领域不断开拓新的市场。
作者：颜旭 顾承医学期刊在线真 张志强 洪厚胜 单位：南京工业大学生物与制药工程学院 南京汇科生物工程设备有限公司