【摘要】目的探讨大黄多糖对糖尿病皮肤创面的疗效及可能机制。方法链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型，2周后手术制作背部创面模型，再随机分为糖尿病组（给予生理盐水）、大黄多糖组（给予大黄多糖）及大黄多糖-SB431542组（给予大黄多糖及TGFβ1受体抑制剂SB431542混合液），另取正常大鼠制作背部创面模型给予生理盐水为对照组。2周后观测创面愈合率，检测创面羟脯氨酸含量，HE染色观测创面肉芽组织生长情况，免疫组化染色检测TGFβ1表达。结果与对照组相比，糖尿病组及大黄多糖-SB431542组创面愈合率明显降低，羟脯氨酸含量减少（均＜0.01），而大黄多糖组无明显变化（＞0.05）。对照组与大黄多糖组真皮层较厚，胶原纤维丰富，而糖尿病组与大黄多糖-SB431542组真皮层较薄，皮下胶原组织较少。糖尿病组TGFβ1表达较对照组减少，大黄多糖组及大黄多糖-SB431542组TGFβ1表达明显增加。结论诱导TGFβ1表达是大黄多糖促进糖尿病皮肤创面愈合的重要机制之一。
【关键词】大黄多糖；糖尿病；皮肤创面；TGFβ1;大鼠
【中图分类号】R587.1【文献标志码】A【DOI】10.16695/j.cnki.1006-2947.2015.06.006
糖尿病微血管病变可导致皮肤营养障碍，皮肤易于受损且伤面修复能力差，患者常继发感染，引起难以愈合的溃疡。糖尿病患者皮肤溃疡发病率约为溃疡迁延不愈，可长达数月到数年之久。[1]30%，糖尿病患者手部、臀部、腰部及足部均可发生皮肤溃疡，其中尤以足部溃疡在糖尿病难治性溃疡中最为常见，其高截肢率和高致残率是糖尿病患者致残、致死的重要原因，给患者带来沉重的家庭负担。[2]中药大黄具有生肌、攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等作用，中药外用创伤药多含有中药大黄。大黄多糖是中药大黄的重要药理成分之一，具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用。本[3]研究拟探讨大黄多糖对糖尿病皮肤创面愈合的影响及机制，为糖尿病皮肤破损的治疗提供依据。
1材料和方法
1.1试剂大黄多糖购自广州泽力医药科技有限公司，HE染色试剂盒购自北京碧云天生物科技有限公司，羟脯氨酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，转化生长因子β-1（transforminggrowthfactor-β1，TGFβ1）抗体及TGFβ1特异性受体拮抗剂SB431542均购自Abcam公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自Sigma公司。1.2动物模型的建立及分组雄性SD大鼠，体质量200~230g（辽宁医学院实验动物中心）；大鼠腹腔注射2%STZ溶液（60mg/kg），48h后尾静脉取血，血糖浓度大于16.7mmol/L[4]即为糖尿病大鼠。糖尿病模型2周后，参照文献，用手术刀切取大鼠的背部制作2.0cm×2.0cm的方形创[3,5]面至皮下组织，形成皮肤创面。参照文献，配制大黄多糖溶液（100mg/L）及大黄多糖-SB431542混合液（大黄多糖100mg/L、SB43154220μmmol/L）。实验分为4组，对照组（正常大鼠给予生理盐水）、糖尿病组（糖尿病大鼠给予生理盐水）、大黄多糖组（糖尿病大鼠给予大黄多糖）、大黄多糖-SB431542组（糖尿病大鼠给予大黄多糖-SB431542混合液），创面每日滴液0.1ml，一次性无菌纱布包扎，连续给药2周。1.3创面愈合率，HE染色给药2周后，将无伸缩性的透明膜覆盖于创面上，描记创面的轮廓，再将该图像扫描输入计算机，利用MIG2000软件计算出创面轮廓面积。该轮廓面积与创面面积的百分比即创面愈合率。取皮肤标本浸入4%多聚甲醛溶液中固定、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化，常规进行HE染色，显微镜下观察并记录各组创面肉芽组织生成情况。1.4创面组织中羟脯氨酸含量测定将创面组织准确称重后，以9倍生理盐水制成10%的组织匀浆，12000rpm离心10min，将上清液稀释至50倍体积，按OHP含量测定试剂盒说明进行操作。1.5免疫组化检测创面组织TGFβ1表达取创面组织，于4%多聚甲醛固定后，常规制作石蜡切片，切片水化后，室温下以血清封闭1h，以TGFβ1抗体孵育，DAB显色后，苏木精轻度复染。逐级酒精梯度脱水、二甲苯透明、封片后显微镜下观察并拍照。利用软件ImageJ，将对照组灰度值设置为100%，测算各组灰度值。统计学分析利用SPSS17.0软件，实验数据用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，＜0.05认为有统计学意义。
2结果
2.1创面愈合率2周后，对照组、糖尿病组、大黄多糖-SB431542组及大黄多糖组创面愈合率分别为（85.6±0.4）%、（66.4±0.5）%、（70.6±0.5）%及（82.3±0.6）%。与对照组相比，糖尿病组及大黄多糖-SB431542组创面愈合率明显降低（均＜0.01），大黄多糖组无明显变化（＞0.05）。2.2创面组织学观察对照组与大黄多糖组真皮层较厚，胶原纤维丰富，可见大量成纤维细胞束，糖尿病组与大黄多糖-SB431542组真皮层较薄，皮下胶原组织较少（图1）。2.3创面羟脯氨酸含量检测对照组、糖尿病组、大黄多糖-SB431542组及大黄多糖组羟脯氨酸含量分别为（14.3±0.7）、（11.2±0.8）、（12.3±0.1）以及（15.1±0.1）μg/mg。与对照组相比，糖尿病组、大黄多糖-SB431542组羟脯氨酸含量降低（均＜0.01），大黄多糖组无明显变化（＞0.05）。2.4创面组织TGFβ1蛋白表达免疫组化染色结果显示，对照组创面组织TGFβ1蛋白淡染，糖尿病组几乎无TGFβ1蛋白表达，而大黄多糖-SB431542组及大黄多糖组TGFβ1蛋白表达呈强阳性（图2）。对照组、糖尿病组、大黄多糖-SB431542组及大黄多糖组TGFβ1蛋白灰度值分别为（100.0±0.0）%、（84.3±7.1）%、（182.3±12.6）%及（179.4±11.7）%，与对照组相比，糖尿病组表达减少，大黄多糖-SB431542组及大黄多糖组表达增加（<0.01），大黄多糖-SB431542组与大黄多糖组组间差异不明显（>0.05）。
3讨论
皮肤创伤愈合是一个复杂的生物学过程，涉及肉芽组织增生、创面炎症反应、新血管发生、基质形成和胶原合成以及上皮化等过程，有多种因子参与和调控。糖尿病时，局部微循环功能障碍，营养因子缺乏，细胞外基质成分及含量改变，成纤维功能细胞降低等多种因素导致糖尿病创伤皮肤愈合困[6]难，常导致患处迁延皮肤不愈。传统中医药在外伤治疗上具有独特疗效，中药大黄常用于外用创伤药[7]的配制，甚至成为外用药的主要成分。但中药大黄化学成分复杂，发挥皮肤创伤治疗作用的有效药理成分尚不清楚，对糖尿病创面愈合的影响及机制仍待探讨。大黄多糖是从中药大黄中提取的一种多糖，能[3]抑制过氧化氢诱导的肠上皮细胞凋亡的，能促进小[8]肠隐窝上皮细胞增殖、移行。羟脯氨酸主要存在于胶原纤维中，其含量与胶原纤维量成正比。本研究发现，糖尿病大鼠皮肤创面羟脯氨酸含量低，创面胶原纤维较少，愈合速度明显减慢，糖尿病大鼠单纯给予大黄多糖能提高羟脯氨酸含量，增加创面胶原纤维含量，促进创面愈合。TGFβ1蛋白在细胞、增殖分化中发挥重要作用，能启动Smads信号通路、ERK信号通路、JNK信号通路以及P38MAPK等信号通路，是促进细胞外基质蛋白合成与聚集的重要因[9]素，与皮肤创面愈合关系密切。本研究也证实糖尿病大[10]鼠创面TGFβ1蛋白表达减少，与文献报道类似，糖尿病大鼠给予大黄多糖增加了创面TGFβ1蛋白表达，促进了创面愈合，这提示TGFβ1表达减少是糖尿病大鼠创面愈合困难的原因之一，而大黄多糖通过PPTGFβ1促进糖尿病大鼠创面的愈合。为进一步证实该观点，设置了大黄多糖-SB431542组，尽管该组创面TGFβ1表达增加，但由于SB431542抑制了TGFβ1的作用，该组创面羟脯氨酸及胶原纤维含量较大黄多糖组明显减少，创面愈合率明显降低。该结果进一步证实，诱导TGFβ1表达是大黄多糖促进糖尿病大鼠皮肤创面愈合的重要机制之一。糖尿病皮肤破损不愈形成难治性溃疡，极大降低了患者的生活质量。本研究证实了大黄多糖对于糖尿病皮肤受损的治疗作用，并探讨了其中的分子机制，对于揭示糖尿病皮肤迁延不愈的机制及临床治疗具有重要意义。
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作者：张岚 刘学政 单位：辽宁医学院人体解剖学教研室